众所周知,疏水填料是根据蛋白表面疏水配基的分布,通过蛋白和层析介质疏水表面可逆的相互作用分离物质的一种层析方式。由于其在分离纯化中优异的高聚与低聚的去除表现,因此疏水填料在融合蛋白与抗体,ADC等纯化中发挥着重要作用。如何更好的使用疏水填料则离不开对疏水填料的深入了解。
疏水填料影响因素
1. 填料的疏水性能 疏水性是填料选择中重要的参考数据,其主要由配基类型(Phenyl>Octyl>Butyl>Butyl-S)、配基密度和基架决定,而疏水性也直接影响目的蛋白的回收率等问题。太阳成tyc7111cc官网也对现有主流疏水填料进行了疏水性排序。
图1:太阳成tyc7111cc官网疏水填料疏水性从弱到强排序
2. 盐溶液的选择
根据疏水层析的原理,不同的盐溶液与盐溶液的浓度可直接改变分子表面疏水配基的数量,从而影响目的蛋白与疏水填料的相互作用。因此,缓冲液盐溶液的选择一般在初期进行筛选和优化。
盐溶液(洗脱能力):
NaSO4>KH2PO4>Na2HPO4>(NH4)2SO4>K2CO3>Na2CO3>NaCl>NaNO3
3. 温度的影响
一遍来说温度升高,疏水作用增加,载量增高;温度降低,疏水作用降低,载量下降。在工艺开发过程中,应保持与放大生产的环境温度一致,防止温差过大,工艺放大出现偏移。
4. 添加剂的选择
在疏水层析过程中,洗脱液中的目的蛋白量较少甚至洗脱不下来的情况,并不少见。基于此,在洗脱过程中加入添加剂,是常用的一种改善蛋白的溶解度,促进蛋白洗脱的方式。常见的添加剂有有机溶剂(异丙醇、乙二醇等)或者表面活性剂以及氨基酸(精氨酸)等。
疏水填料的应用 应用1 填料名称:MaXtar? Phenyl HR 柱体积:4.7 mL 目的蛋白:BsAb (130 mS/cm) 载量:30 mg/mL 平衡缓冲液:20 mM Tris-HCl,1M (NH4)2SO4 ,pH 7.4 洗脱缓冲液:20 mM Tris-HCl,pH 7.4
图2:MaXtar? Phenyl HR层析图谱
表1:MaXtar? Phenyl HR纯化前后
SEC_HPLC(%)结果
应用2 填料名称:Phenyl Chromstar? HP 柱体积:H=15 cm,D=26 mm 目的蛋白:带状疱疹疫苗(VZV)(90-105 mS/cm) 平衡缓冲液:PBS,0.6 M (NH4)2SO4 洗脱缓冲液:纯化水
图3:Phenyl Chromstar? HP层析图谱
表2:Phenyl Chromstar? HP纯化前后
SEC_HPLC(%)结果
小结:
应用1:使用MaXtar? Phenyl HR纯化双抗SEC_HPLC(%)从95.41%提高到99.4%,高聚降低4%,具有显著的高聚去除效果。
应用2:Phenyl Chromstar? HP 纯化带状疱疹疫苗后SEC_HPLC(%)达到98%,纯化效果显著。
应用技巧: 1. 疏水填料的选择 可根据目的蛋白的性质按照疏水性的不同来选择疏水配基,若不了解目的蛋白性质则可优先选择Phenyl配基进行测试,结合具体情况,考虑是否更换填料。 2. 上样缓冲液的选择 疏水缓冲液中常用盐溶液为(NH4)2SO4与NaCl,其中(NH4)2SO4一般浓度范围为0.5-1.5 M (NH4)2SO4 ,而NaCl一般浓度范围为3 M NaCl以内,可根据具体情况选择盐溶液。 3. 洗脱过程优化 疏水填料进行线性洗脱,根据洗脱情况进行工艺调整,若洗脱目的蛋白与杂蛋白分离较好,可尝试一步洗脱;若分离度较差,可缩小线性范围,降低坡度,来提高分辨率;若洗脱蛋白较少或较难洗脱则可通过添加剂或者更换盐溶液进行优化。
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